烟草遗传转化技术

一、准备

1.无菌培养（30天）的烟草植株

2.镊子，剪刀，解剖刀，放有5-6层滤纸的培养皿（直径12厘米）

二、转化程序

（一）菌液准备

实验前一天，挑取接种转化用的农杆菌单克隆于10毫升LB培养基中（添加50mg/l利福平和卡那霉素），过夜培养。

（二）烟草的农杆菌侵染

1.共培养培养基配制：MS培养基+NAA（0.1mg/L）+6-BA(1.5mg/L)。

2.用剪刀和镊子从无菌培养的烟草上切下生长健壮的叶片放到玻璃皿中。

3.在玻璃皿中用解剖刀将叶片切成约0.5-1cm²的小块，刀片快速划过叶片，切下叶块，尽量保证切口整齐。用镊子将切好的叶片夹到OD值为0.4-0.6的农杆菌液中浸泡8-10分钟。

4.将菌液倒出，用镊子将叶片转移到玻璃皿中的滤纸上，以吸去叶片上的菌液，超净工作台上放置一段时间吸干叶子表面的菌液。

5.吸干菌液的叶片放置到共培养培养基上，25度暗培养三天。

（三）转化烟草的分化筛选培养

1.培养基配制：MS+1.5mg/L6-BA+0.1 mg/L NAA+30 mg/L潮霉素+100mg/L头孢。

2.将共培养三天后的烟草叶片转移到培养基上，尽量使叶片接触和贴着培养基表面，叶片之间留一定的空隙。25度光照条件下培养。

3.在光照培养室中培养两至三周长出烟草幼芽，将小芽剪出来转移到壮苗培养基（MS+0.1mg/L6-BA+0.01mg/LNAA+30mg/L潮霉素+100mg/L头孢）。

4.约一周左右后，挑出长出根的烟草苗转移到生根培养基（MS +30mg/L潮霉素+100mg/L头孢）上。

5.烟草苗PCR鉴定。